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本试剂盒适用于带有3'-末端A突出的PCR产物的克隆，包含T载体以及TOP10感受态细胞在内的全套试剂盒，更加便于用户进行TA克隆。如Taq DNA聚合酶、Tth DNA聚合酶等扩增的PCR产物在3'-末端后都带有一个突出的碱基A，这样的PCR产物可以用3'-末端后带有一个突出碱基T的载体方便地进行克隆。

为了获得快速高效的连接效果，本试剂盒采用了一种特殊的高活力Rapid Ligation Buffer，确保在短时间内可以获得很好的连接效果。独特连接系统允许用户在10分钟的时间里完成连接反应。连接产物可以用M13通用引物和T7启动子引物对PCR产物进行测序。T Vector含有T7 RNA聚合酶的启动子，可以对插入片段进行体外转录。

• 实验准备。
  自备试剂：SOC培养基、IPTG、X-Gal等。
  a.PCR产物3'末端带有突出的A碱基
  Taq、Tth、AmpliTaq、KlenTaq DNA聚合酶扩增的PCR产物3'末端均带有突出的A碱基。建议扩增的PCR产物通过琼脂糖凝胶电泳进行回收，再进行连接转化实验，可以使用柱式DNA胶回收试剂盒。如果PCR扩增产物特异性很高，可直接使用柱式PCR产物纯化试剂盒纯化PCR产物。
  b.PCR产物3'末端没有突出的A碱基
  Pfu、Pwo、Tli或DeepVent等DNA聚合酶具有3'-5'外切酶活性，其扩增的PCR产物末端可能不带有3' A，要对这种平末端PCR产物进行克隆，应先对其进行3'末端加A，再进行连接转化实验。建议选用平端DNA加dA试剂盒进行加A实验。
  
• 在0.2mL PCR管中配制下列连接体系。
  

  成分	用量
  插入的目的片段	x μL(0.2pmol)
  T载体(50ng/μL)	1μL
  2×Rapid Ligation Buffer	5μL
  50% PEG 4000	1μL
  T4 DNA连接酶(5U/μL)	1μL
  无菌ddH2O	至10μL

  • 一般最后加入T4 DNA Ligase。
    
  • 2×Rapid Ligation Buffer使用前一定要完全溶解并混匀，加入到连接体系后也须注意混匀。
• 22℃连接10分钟。
  
• 将100μL感受态细胞置于冰上解冻后，加入上述10μL连接液，轻轻混匀，冰上放置30分钟。
  
• 42℃水浴热激45秒，迅速放回冰中放置2分钟左右，注意不要晃动。
  
• 加入700μL不含抗生素的无菌培养基，37℃振荡培养1小时。
  
• 吸取适量体积均匀涂布到含20μL IPTG(100mM)和100μL X-gal(20mg/mL)的氨苄青霉素抗性的LB平板上。
  
  涂布菌液的用量可以根据连接的效率及感受态细胞的转化效率而进行适当的调整。
  
  
• 将平板于37℃培养1小时，然后倒置培养过夜。
  
  先将平板正向放置1小时，以吸收过多的液体。
  
  
• 用牙签挑取白色菌落，以M13通用引物或基因特异性引物进行PCR扩增，确认载体中插入片段的长度大小。或将白色菌落挑至含氨苄青霉素的液体培养基中37℃培养过夜，提取质粒后进行酶切鉴定。

• PCR产物的纯度
  连接反应前需用琼脂糖凝胶电泳检测PCR反应产物，如果电泳检测PCR产物条带弥散，或出现非特异条带，则需要切下目的条带，用胶回收试剂盒对目的片段进行回收。若PCR产物电泳检测只有预期大小的明显条带，也应使用PCR产物纯化试剂盒直接纯化PCR产物，以除去引物二聚体。不经纯化的PCR产物在某些条件下可直接用于连接，但由于引物二聚体和PCR产物中其它物质的影响，造成含有插入片段的阳性克隆数减少，因而需要筛选很多克隆方可得到含有目的PCR产物的阳性克隆。
  
• 平端PCR产物
  具有校正活性的热稳定性DNA聚合酶如Pfu、Pwo、Tli在进行PCR扩增时产生平端PCR产物。这种平端PCR产物可以进行3'末端加A尾后连接到T Vector中，采用这种方法进行连接，可大大提高克隆的效率。
  
• 优化插入片段和载体的摩尔比
  T Vector优化的插入DNA片段和载体的摩尔比为3:1，采用3~10:1的连接比例也可成功进行连接。如果你的PCR产物开始连接的不理想，则有必要优化连接比例。PCR产物的量可采用以下公式进行换算：
  
  PCR片段的量(ng)＝[加入载体的量(ng)×插入片段大小(kb)/载体大小(kb)]×插入片段和载体的摩尔比
  
  
• 筛选含插入片段的转化子
  插入片段成功克隆到T Vector中，可阻断β-半乳糖苷酶的编码序列，因而重组克隆可在指示培养基上通过颜色进行筛选。大多数情况下含有PCR产物的克隆菌为白色，如果PCR片段和LacZ基因在同一读码框内，即PCR片段碱基数是3的整数倍(含3'-A)，并且读码框无终止密码子，则重组克隆菌可能为蓝色。